Se presume como el recinto con el mayor acervo, a nivel nacional, en temáticas guadalupana y mariana, especialmente representado en arte pictórico novohispano. Figuran artistas como Baltasar de Echave Ibía, José de Alcíbar, Juan Correa y Juan Cordero. Destacan las obras de los siglos XVII y XVIII, basadas en el Nican Mopohua -atribuido al indígena Antonio Valeriano-; en las que se mira la imagen de la Virgen de Guadalupe rodeada por medallones en que se representan cuatro de las apariciones a Juan Diego; algunas de ellas son firmadas por Miguel Cabrera, Juan Antonio de Arriaga, Francisco Carden, Josefus de Rivera I Argomanis, entre otros más.

Como parte del acervo hay escultura policromada, escultura en mármol y marfil, libros, grabados, orfebrería, mobiliario de origen mexicano, latinoamericano y europeo, estandartes, gobelinos, vestimenta litúrgica y tapices. 

No hay que perder de vista la colección de más de dos mil Exvotos Guadalupanos fechados en los siglos XIX y XX; en los que es evidente el sentido de mexicanidad y los vínculos religiosos.

Para conocer el tesoro sacro aquí guardado es preciso dirigirse atrás del Templo Expiatorio donde aparecen las salas del museo guadalupano en los espacios que antes fueron la sacristía, la sala capitular, el salón de obispos, el patio, la colecturía, entre otros.